سديم به مدت 20 روز اعمال گرديد. مقدار کلريد سديم مصرفي براي تيمار 5 دسي زيمنس بر متر به ازاء 1 ليتر 3 گرم، براي تيمار 10 دسي زيمنس بر متر به ازاء 1 ليتر 5/6 گرم و و براي تيمار 20 دسي زيمنس بر متر 5/13 گرم بود. که جهت ايجاد زهکشي مناسب و جلوگيري از تجمع نمک در گلدانها، در زير تمامي گلدان‌ها سوراخهاي مناسبي تعبيه شد. همچنين هر هفته يکبار تمامي گلدان‌ها به وسيله آب معمولي آبياري شدند. پس از اعمال تنش، صفاتي نظير وزن خشک برگ، وزن خشک ريشه، ارتفاع ساقه، سطح برگ، مقدار پرولين، قندهاي محلول و مواد معدني مثل سديم، پتاسيم، کلسيم و منيزيم اندازه‌گيري شدند.

3-4- فرمول غذايي هوگلند:
اين فرمول غذايي توسط هوگلند و آرنون (1950) ارائه شده است. با توجه به اينکه در ابتداي رشد از يک چهارم محلول هوگلند استفاده شد، پس کليه مقادير جدول (3-2) که براي نيم‌هوگلند بودند، به نصف کاهش يافت (4 ماده اول که مواد غذايي ماکرو هستند نصف ميزان ذکر شده براي 60 ليتر آب استفاده شد). محلول‌ها با همان نسبت تهيه شدند ولي حجم مورد استفاده در 60 ليتر محلول نيمهوگلند 500 سيسي بود.
جدول 3-2- طرز تهيه محلول نيم هوگلند
حجم مورد استفاده (ميليليتر) در 60 ليتر نيم هوگلند
ميزان ترکيب (گرم) در يک ليتر
مواد
75
202
نيترات کلسيم*
75
472
نيترات پتاسيم*
30
493
سولفات منيزيم*
30
80
نيترات آمونيوم*
45
86/2
سولفات آهن II
15
81/1
کلريد منگنز
15
22/0
سولفات روي
15
051/0
سولفات مس
15
09/0
اسيد موليبديک
15
15
اسيد بوريک
15
136
پتاسيم ديهيدروژن فسفات
*عناصر ماکرو ميباشند
ترکيبات شماره 1 و 2 به سختي حل ميشوند و بايد به طور کامل در آب حل شوند.
3-5- روشهاي نمونه برداري و اندازهگيري صفات مورد بررسي
20 روز بعد از اعمال شوري، از هر گلدان سه بوته که داراي برگ سبز بودند، انتخاب گرديد و نمونهگيري از گلدانها در ساعت 8 صبح انجام شد. به منظور جلوگيري از تغيير ميزان پرولين و قندهاي محلول، نمونهها در طي انتقال به آزمايشگاه، در ظرف حاوي يخ خشک قرار داده شدند و تا زمان استفاده در دماي 40- درجه سانتيگراد نگهداري شدند. پس از 20 روز که اعمال شوري تمام شد، صفات ديگر مانند طول ساقه، وزن خشک ريشه، وزن خشک برگ، سطح برگ و مواد معدني (Na+، K+ ، Ca2+ و Mg2+ ) به شرح زير اندازه‌گيري شدند.

3-5-1- اندازه‌گيري سطح برگ
به ‌منظور اندازه‌گيري سطح برگ، تعدادي بوته با برگ‌هاي سالم انتخاب و از هر يک 5 برگ با اندازه‌هاي مختلف از محل زبانک قطع گرديد و طول برگ و عرض وسط برگ با خط‌کش بر حسب سانتي‌متراندازه‌گيري شد. سپس با استفاده از فرمول زير سطح برگ محاسبه شد (باقري، 1385).

LMed 677/0 + Med 336/12 = Y
که در آن Y، سطح برگ و LMed، طول برگ * عرض وسط برگ و Med عرض وسط برگ مي‌باشند.

3-5-2- اندازه‌گيري وزن خشک برگ و ريشه
براي اندازه‌گيري وزن خشک برگ و ريشه، نمونه‌ها به مدت 48 ساعت در دماي 74 درجه سانتي‌گراد خشک شدند و سپس با ترازوي ديجيتالي توزين شدند.

3-5-3- اندازهگيري پرولين و قندهاي محلول کل
3-5-3-1- تهيه عصاره الکلي
جهت اندازهگيري ميزان پرولين و قندهاي محلول ابتدا لازم بود از برگها عصاره الکلي تهيه شود. بدين منظور ابتدا 5/0 گرم از بافت برگ، نگهداري شده در فريزر (دماي 40- درجه سانتيگراد) انتخاب و در هاون بدون حضور نيتروزن مايع کاملاً له گرديد. سپس 5 ميليليتر اتانول 95 درصد به آن اضافه و به لوله آزمايش درب دار منتقل گرديده و به مدت 30 ثانيه ورتکس (به شدت تکان داده ) شد. سپس مايع رويي جدا شده و به لوله دربدار به حجم 20 ميليليتر منتقل شد. پس از آن، دو مرتبه و هر بار 5 ميليليتر اتانول 70 درصد به بخش جامد باقيمانده اضافه و کاملاً شستشو گرديد. کليه مراحل بالا در حمام يخ و نور کم انجام گرفت. بخش مايع رويي به لوله آزمايش منتقل شد. در نهايت، 15 ميليليتر از عصاره بدست آمده به مدت 15 دقيقه سانتريفيوژ شد ( 3500 دور در دقيقه) و فاز مايع بالايي به دقت جدا و به يخچال 40 درجه سانتي‌گراد منتقل گرديد (ترک نژاد، 1378؛ پاکوئين و لچاژر60، 1979).
3-5-3-2- اندازهگيري پرولين
براي اندازهگيري پرولين از روش پاکوئين و لچاژر (1979) به شرح زير استفاده شد. ابتدا به تعداد تيمارها لوله آزمايشي درب‌دار به حجم حداقل 30 ميليليتر تهيه گرديد. در مرحله بعد، 1 ميليليتر از عصاره الکلي را به لولههاي مذکور منتقل و 10ميليليتر آب دو بار تقطيرشده به آن اضافه گرديد. سپس 5 ميليليتر ناينهيدرين (به ازاي هر نمونه 125/0 گرم نينهيدرين در 2 ميليليتر اسيدفسفريک 6 مولار و 3 ميليليتر اسيداستيک گلاسيال 9/99% ريخته شد) به نمونهها اضافه شد و به مدت 16 ساعت با استفاده از همزن مگنتدار کاملاً حل گرديد. بعد از آن 5 ميليليتر اسيد استيک گلاسيال (9/99%) به هر نمونه اضافه گرديد و داخل حمام آب جوش (بنماري) به مدت 45 دقيقه قرار داده شدند. نمونهها خارج شده و در دماي محيط خنک گرديدند. بعد از آن، به هر نمونه 10 ميليليتر بنزن اضافه کرده و به شدت تکان داده شدند، تا پرولين وارد فاز بنزن گردد. بعد از اين مرحله، نمونهها به مدت نيم‌ساعت به حالت سکون نگهداري و سپس ميزان جذب نور نمونهها در طول موج 515 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر ) مدلSHIMADZO 54A ( قرائت گرديد.
قبل از انجام مراحل فوق استاندارهايي از پرولين (ال-پرولين61) با غلظتهاي 0، 01/0، 02/0، 03/0، 04/0، 05/0، 1/0، 2/0، 3/0، 4/0، 5/0، 6/0، 7/0، و 8/0 ميکرومول بر ميليليتر تهيه گرديد. بدين منظور ابتدا محلول يک ميليمولار از پرولين تهيه گرديد که به عنوان محلول مادر از آن استفاده شد. براي تهيه محلول مادر 13/115 ميليگرم پرولين (با دقت 0001/0گرم) در يک ليتر آب دوبار تقطير شده حل گرديد. بايد توجه نمود که ال- پرولين در آب کاملاً حل ميشود. بدين ترتيب يک ميليليتر از محلول يک ميلي‌مولار مادر حاوي يک ميکرومول بر ميليليتر پرولين ميباشد. در جدول 3- 3 حجم محلول مادري و ميزان آب دوبار تقطير مورد نياز براي تهيه استاندارهاي با غلظت مشخص ارائه شده است. کليه عملياتي که بر روي نمونهها انجام ميشد بر روي استاندارها نيز انجام گرفت و سپس منحني کاليبراسيون (شکل 6-2) رسم، و ميزان پرولين آزاد نمونهها براساس ميکرومول بر گرم وزن تر برگ محاسبه گرديد.

جدول 3-3- حجم محلول مادري و آب دوبار تقطير مورد نياز جهت تهيه استانداردهاي پرولين با غلظتهاي مشخص
حجم اّب دوبار تقطير اضافه شده (ميليليتر) براي تهيه 50 ميليليتر محلول استاندارد
حجم برداشت شده (ميليليتر) از محلول يک ميليمولار مادري
غلظت استاندارد (ميکرومول بر ليتر)
رديف
50
0
صفر
1
5/49
5/0
01/0
2
49
1
02/0
3
5/48
5/1
03/0
4
48
2
04/0
5
5/47
5/2
05/0
6
45
5
1/0
7
40
10
2/0
8
35
15
3/0
9
30
20
4/0
10
25
25
5/0
11

3-5-3 -3 اندازهگيري قندهاي محلول کل62 ((TSS
براي اندازه گيري قندهاي محلول نيز از روش ايريگوئن63 و همکاران (1992) استفاده شد. بدين صورت که ابتدا به تعداد تيمارهاي آزمايشي لولههاي دربدار انتخاب گرديد. بعد 1/0 ميليليتر از عصاره الکلي انتخاب و داخل لوله آزمايش ريخته شد. سپس 3 ميليليتر آنترون تازه تهيه شده و به لوله آزمايش اضافه و به مدت 10 دقيقه در حمام آب جوش قرار داده شد. براي تهيه آنترون، 150 ميليگرم آنترون در 100 ميليليتر اسيد سولفوريک 72% (حجم/وزن= w/v ) حل شد. توجه شود که آنترون بايد با توجه به تعداد نمونهها به صورت تازه در هر روز تهيه گردد. پس از خنک شدن نمونهها در محيط آزمايشگاه، ميزان جذب نمونهها در طول موج 625 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گرديد. قبل از انجام مراحل فوق استانداردهايي از گلوکز با غلظتهاي 0، 25، 50، 100، 500 و 1000 قسمت در ميليون (پي پيام) تهيه گرديد و کليه مراحل مذکور روي آنها انجام شد. سپس منحني کاليبراسيون با استفاده از استاندارد گلوکز رسم و ميزان قندهاي محلول نمونهها بر اساس ميليگرم در هر گرم وزن تر برگ محاسبه گرديد (ترکنژاد، 1378). قابل ذکر است که دستگاه با آنترون کاليبره ميشود و آنترون هم مثل بقيه نمونهها بايد در حمام آبجوش قرار بگيرد.

3-5-4- مواد معدني برگ
پهنکهاي جوان‌ترين برگهاي باز شده بوتهها در هر کدام از گلدانها جدا گرديدند. نمونههاي برداشت شده با آب مقطر کاملاً شسته شدند و به مدت دو روز در دماي 70 درجه سانتيگراد در آون خشک شدند. سپس نمونههاي خشک شده برگها با وزن متفاوت را توزين و در کوره با دماي 500 درجه سانتيگراد به مدت 5 ساعت خاکستر شدند. خاکستر مورد نظر را با اضافهکردن 5 ميليليتر اسيدکلريدريک 2 نرمال روي گرم کننده قرار داده شد. با شروع جوشيدن، محلول حاصل را از کاغذ صافي عبور داده و حجم نمونهها با آب دو بار تقطير شده به 70 ميليليتر رسانيده شد. سپس مقادير سديم و پتاسيم نمونههاي برگي با استفاده از دستگاه فليمفتومتر برحسب ميليگرم بر گرم وزن خشک قرائت گرديد، و اعداد قرائت شده بهوسيله مقايسه با نمودار حاصل از نمونههاي استاندار تعديل شدند (پترسون64 و همکاران، 1984). کلسيم و منيزيم نيز با استفاده از دستگاه جذب اتمي اندازه‌گيري شدند.

3-5-4-1- طرز تهيه استاندارد پتاسيم
477/0 گرم نمک کلريد پتاسيم ((KCl اندازه‌گيري و در ارلن ريخته شد. سپس با آب مقطر حجم آن به 500 ميلي ليتر رسانيده شد. براي بدست آوردن محلول استاندارد ، بايد محلول را به نسبت 1:50 رقيق کرد (حجم 500 ميلي ليتر). بنابراين 477/0 گرم KCl شامل 25/0گرم پتاسيم است.
وزن مولکولي کلريد‌پتاسيم (56/74 گرم بر مول)
وزن اتمي پتاسيم (1/39 گرم بر مول)
) 477/0 × 1/39 ( / 56/74=25/0
لذا در 500 ميلي‌ليتر محلول 250 ميلي‌گرم پتاسيم وجود دارد و يا به عبارت ديگر محلول 50 ميلي‌گرم پتاسيم در 100 ميلي‌ليتر آب ميباشد. با استفاده از رقيق کردن با نسبت 1:50 محلول استاندارد بدست ميآيد که غلظت استاندارد معادل يک ميلي‌گرم پتاسيم در 100 ميلي‌ليتر آب ميباشد.
3-5-4-2- طرز تهيه استاندارد سديم
637/0 گرم نمک کلريد‌سديم خالص را وزن کرده و درون يک بالن حجمي ريخته و به حجم 500 ميلي‌ليتر مي‌رسانيم.
وزن مولکولي نمک طعام (64/58 گرم بر مول)
وزن اتمي سديم (23 گرم بر مول)
) 637/0 × 23 ( / ) 64/58 (= 25/0
لذا در 500 ميلي‌ليتر محلول 250 ميلي‌گرم سديم وجود دارد و يا به عبارت ديگر، محلول حاوي 500 ميلي‌گرم سديم در يک ليتر آب مي‌باشد.

3-5-5- تجزيه و تحليل داده‌هاي آزمايش اول
تجزيه داده‌ها با استفاده از نرمافزار SAS 9.1 صورت گرفت. مقايسه ميانگين برهمکنش فاکتورها به روش LSmeans انجام شد. اجزاي تشکيل‌دهنده واريانس با استفاده از اميد رياضي ميانگين مربعات تجزيه مرکب در قالب طرح آماري فاکتوريل کامل تصادفي برآورد و سپس قابليت توارث، ضرايب تنوع فنوتيپي و ژنتيکي محاسبه گرديدند (نعمت‌زاده و کياني، 1383). به منظور محاسبه قابليت وراثت پذيري عمومي از روابط زير استفاده گرديد )نعمت زاده و کياني، 1383).

تجزيه واريانس طرح فاکتوريل کامل تصادفي براي صفات مورد بررسي
منابع تغيير
درجه آزادي
ميانگين مربعات
اميد رياضي
ژنوتيپ (g)
g-1
MSg
?2?+ r ?2g
تکرار (r)
r-1
MSr
?2?+ g ?2g
اشتباه (e)
(g-1)(r-1)
MSe
?2?
کل
gr-1

در روابط زير h2 وراثت‌پذيري عمومي، ?2g واريانس ژنوتيپي، ?2 p واريانس فنوتيپي، ?2e واريانس خطا، CVg ضريب تغييرات

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید